Музейная коллекция живописи - одна из самых крупных и интересных на Юге России, в ней выделяются наиболее ценные:

I. Коллекция Н.Н. Дубовского.
  Музей истории донского казачесва в настоящее время располагает самой большой и полной в стране коллекцией картин художника Н. Н. Дубовского - казака, уроженца г. Новочеркасска, занимающего видное место в ряду выдающихся русских пейзажистов.
  Н. Дубовской учился в Санкт-Петербургской Академии художеств, занимаясь по классу пейзажа в мастерской профессора М. К. Клодта. В 1886 г. становится членом Товарищества передвижных художественных выставок, а с 1899 года входит в правление и вплоть до своей кончины остается бессменным руководителем Товарищества.
  Императорская Академия Художеств в 1898 г. избирает его академиком пейзажной живописи. В 1900 году Дубовской избирается действительным членом Академии художеств, в 1911 году - профессором, руководителем пейзажной мастерской Академии. Н.Н. Дубовской один из немногих русских пейзажистов, удостоен золотых и серебряных наград за участие в художественных международных выставках в Париже, Мюнхене и Риме. Картины мастера кисти экспонируются в Третьяковской галерее, Русском музее и многих других музеях страны.
  Н. Н. Дубовской мечтал о создании в родном городе картинной галереи. Для нее он собирал свои произведения и картины художников-передвижников. Коллекцию картин художник завещал землякам. Произведения поступили в музей в 1946 году из Русского музея, где хранились после смерти художника.

  В настоящее время портретное собрание музея составляют коллекции:
1. Донская парсуна,
2. Атаманский портрет,
3. Знаменитости Дона,
4. Портреты царствующих особ,
5. Портреты участников войны 1812 г.

  Кроме того, музей представляет коллекцию западноевропейской живописи, работы художников-передвижников.
Отдельные филиалы музея посвящены новочеркасским художникам - И.И. Крылову и М.Б. Грекову.

II. Донская парсуна.
Атаманский портрет.
Знаменитости Дона.
  Донской парадный портрет - донская парсуна - уникальное своеобразное и самобытное явление в русской культуре, доносящее до нас суть казачьей эстетики, красоту донского костюма и правдивый характер портретируемого.
  Первая портретная галерея появилась на Дону в 1750-е годы в усадьбе Войскового Атамана Данилы Ефремова, в Красном урочище около Черкасска. Пользуясь привилегией старшин быть изображенным, он заказал свой собственный портрет. В период правления его сына - Степана Даниловича, принявшего из рук отца пернач Войскового Атамана, коллекция обогатилась изображениями родственников, произведениями столичной школы - портретами царствующих особ и знаменитостей Дона.
  По завещанию невестки С. Д. Ефремова - Авдотьи Акимовны, галерея хранилась в Старочеркасском женском монастыре, а затем размещалась в Атаманском дворце в Новочеркасске. В начале ХХ века картины были переданы в Донской музей, но во время гражданской войны, вместе с другими казачьими реликвиями, были вывезены за рубеж. Вторично поступили в музей в 1946 году из Праги.